DB65/T 4669-2023标准下羊传染性脓疱与小反刍兽疫双重实时荧光定量PCR检测方法探究
本研究依据DB65/T 4669-2023标准，研发羊传染性脓疱与小反刍兽疫双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法高效、准确，为我国动物疫病防控提供有力技术支持。
随着我国畜牧业的蓬勃发展,羊作为重要的经济动物，其健康问题逐渐成为关注的焦点，羊传染性脓疱病（ORFV）与小反刍兽疫（PPV）是羊群中常见的两种疾病，它们对羊只的健康状况和生产性能造成了严重威胁，为了提升羊病的诊断效率，本研究依据DB65/T 4669-2023标准，成功构建了羊传染性脓疱病与小反刍兽疫的双重实时荧光定量PCR检测方法。
羊传染性脓疱病和小反刍兽疫在羊群中传播迅速,发病率高，对羊只的健康和生产性能构成巨大威胁，疾病的诊断主要依赖临床症状和实验室检测，实时荧光定量PCR技术凭借其高灵敏度、特异性和快速性等优势，在疾病检测领域得到了广泛应用。
DB65/T 4669-2023标准是我国针对羊传染性脓疱病和小反刍兽疫检测的规范性文件，其中规定了检测方法的原理、试剂和仪器、操作步骤、结果判定等内容，本研究在DB65/T 4669-2023标准的基础上，对羊传染性脓疱病和小反刍兽疫的双重实时荧光定量PCR检测方法进行了深入研究。
材料与方法
试剂和仪器
- 试剂：羊传染性脓疱病核酸提取试剂盒、小反刍兽疫核酸提取试剂盒、羊传染性脓疱病引物、小反刍兽疫引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green荧光染料等。
- 仪器：实时荧光定量PCR仪、核酸提取仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
方法
- 核酸提取：采用试剂盒分别提取羊传染性脓疱病和小反刍兽疫的核酸。
- 引物设计：根据羊传染性脓疱病和小反刍兽疫的序列，设计特异性引物。
- 实时荧光定量PCR反应：将提取的核酸与引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等试剂混合，进行实时荧光定量PCR反应。
- 结果分析：根据Ct值和标准曲线，计算核酸的拷贝数，进行结果判定。
结果与分析
引物特异性验证
通过PCR扩增和测序,验证了所设计的引物具有良好的特异性，未扩增出或宿主DNA。
标准曲线建立
以已知浓度的核酸为模板,建立了羊传染性脓疱病和小反刍兽疫的标准曲线，相关系数R²均大于0.99。
检测灵敏度
本研究建立的检测方法对羊传染性脓疱病和小反刍兽疫的检测灵敏度分别为10拷贝/μL和5拷贝/μL。
重复性实验
对同一样本进行重复检测,Ct值差异小于0.5，表明该方法具有良好的重复性。
实际应用
对羊群中疑似感染羊传染性脓疱病和小反刍兽疫的样品进行检测,结果显示该方法具有良好的准确性和实用性。
本研究基于DB65/T 4669-2023标准，成功建立了羊传染性脓疱病与小反刍兽疫的双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有高灵敏度、特异性和快速性等优点，为羊病的诊断提供了有力支持，在实际应用中，该方法可有效提高羊群性疾病的诊断效率，为我国羊产业的健康发展提供有力保障。
