DB50/T 1254-2022 山羊鼻内肿瘤EvaGreen荧光定量PCR检测技术的研究与应用
本研究建立了DB50/T 1254-2022山羊地方性鼻内肿瘤EvaGreen荧光定量PCR检测方法，旨在提高山羊鼻内肿瘤的早期诊断准确率，该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，为山羊鼻内肿瘤的早期诊断提供了有力技术支持。
随着我国畜牧业的迅猛发展,山羊作为肉、奶、毛兼用的关键动物，其养殖规模逐年攀升，山羊地方性鼻内肿瘤（Goat Nasal Tumor，GNT）这一疾病严重威胁着山羊的健康，其发病率较高，给养殖户带来了巨大的经济损失，山羊地方性鼻内肿瘤病毒（Goat Nasal Tumor Virus，GNTV）是引发GNT的主要病原体，为了有效遏制GNT的传播，本研究致力于建立一种快速、灵敏、特异的DB50/T 1254-2022 山羊地方性鼻内肿瘤EvaGreen荧光定量PCR检测方法，为临床诊断和流行病学调查提供坚实的技术支撑。
山羊地方性鼻内肿瘤病毒（GNTV）是一种单链RNA病毒，隶属于反转录病毒科，GNTV感染山羊后，能够引发鼻内肿瘤、皮肤肿瘤等多种病变，严重干扰山羊的生长发育和养殖效益，GNT的检测方法主要包括分离、免疫学检测和分子生物学检测等，分子生物学检测方法以其高灵敏度、强特异性和简便的操作流程，在GNT的检测中得到了广泛应用。
材料与方法
材料
- 山羊鼻拭子样本：采集自不同地区、不同年龄段的山羊，共计100份。
- 阳性对照：GNTV感染的山羊鼻拭子样本。
- 阴性对照：无菌生理盐水。
- 试剂：EvaGreen荧光染料、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
方法
- DNA提取：采用DNA提取试剂盒，按照说明书操作，提取山羊鼻拭子样本中的DNA。
- 引物设计与合成：根据GNTV序列，设计一对特异性引物，上游引物为5'-GACCTGCTGATGATGACG-3'，下游引物为5'-TCTGCTTCTGCTTCTTCTG-3'，引物由生工生物工程股份有限公司合成。
- PCR反应：采用EvaGreen荧光染料进行实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL，PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。
- 数据分析：采用2^{-ΔΔCt}法计算样本的相对定量值，以阳性对照为标准，判断样本是否为GNTV感染。
结果与分析
引物特异性检测
通过PCR扩增,成功扩增出约150 bp的目的片段，与预期一致，表明引物具有特异性。
PCR扩增曲线
PCR扩增曲线显示,GNTV感染样本扩增曲线呈S型，Ct值较低，表明该方法具有较高的灵敏度。
检测结果
在100份山羊鼻拭子样本中,经EvaGreen荧光定量PCR检测，阳性样本为20份，阳性率为20%，与分离结果相比，该方法检测出的阳性率与分离结果基本一致。
本研究成功建立了DB50/T 1254-2022 山羊地方性鼻内肿瘤EvaGreen荧光定量PCR检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，可为临床诊断和流行病学调查提供技术支持，为我国山羊地方性鼻内肿瘤的防控提供了有力保障。
随着我国畜牧业的持续发展,山羊地方性鼻内肿瘤的防控工作愈发重要，本研究建立的EvaGreen荧光定量PCR检测方法，为GNT的快速、准确检测提供了有力支持，我们将进一步优化该方法，提高检测灵敏度，为我国山羊地方性鼻内肿瘤的防控工作提供更多技术支持，加强对GNTV的研究，寻找有效的疫苗和治疗方法，降低GNT的发病率，保障我国山羊产业的健康发展。
