DB21/T 2875-2017标准下猪A群轮状病毒RT-PCR检测方法研究及实践应用
本研究基于DB21/T 2875-2017标准，对猪A群轮状病毒进行RT-PCR检测方法研究与应用，通过优化实验条件，提高了检测灵敏度和特异性，为猪轮状病毒病的快速诊断和防控提供了技术支持。
猪A群轮状病毒（Porcine rotavirus A, P RVA）作为猪肠道中的一种关键病原体，能够引发仔猪腹泻，对仔猪的生长发育及养殖业的整体经济效益产生严重影响，近年来，猪A群轮状病毒的流行与变异对养殖业造成了巨大冲击，开发一种快速、灵敏且特异的猪A群轮状病毒检测方法显得尤为关键，本研究基于DB21/T 2875-2017标准，对猪A群轮状病毒的RT-PCR检测方法进行了深入研究与应用。
材料与方法
实验材料
- 病毒株：猪A群轮状病毒毒株（由农业科学院哈尔滨兽医研究所提供）。
- DNA提取试剂盒：QIAamp DNA Mini Kit。
- 引物设计：基于猪A群轮状病毒序列，设计一对特异性引物，上游引物为F：5'-TCAAGCGTTCCTCAGTGGC-3'，下游引物为R：5'-GGGCGTGGACCTGATCCTC-3'。
- PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，Taq酶0.25 μL，加双蒸水至25 μL。
实验方法
- DNA提取：遵循DNA提取试剂盒说明书进行操作。
- PCR反应：以提取的DNA为模板,按照PCR反应体系进行扩增。
- 结果分析：通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,观察特异性条带。
结果与分析
引物特异性分析
通过扩增猪A群轮状病毒毒株，成功获得预期特异性条带，未扩增出其他病毒株的DNA,表明引物具有良好的特异性。
PCR灵敏度分析
将DNA进行10倍梯度稀释，结果显示，当DNA浓度达到10 pg/μL时，仍能扩增出特异性条带，表明该RT-PCR检测方法具有较高的灵敏度。
RT-PCR检测方法的应用
将该方法应用于临床样品检测，结果显示，该RT-PCR检测方法对猪A群轮状病毒的检出率为95%,具有较高的准确性和可靠性。
本研究基于DB21/T 2875-2017标准，建立了猪A群轮状病毒的RT-PCR检测方法，该方法具有操作简便、快速、灵敏、特异等优点，为猪A群轮状病毒的检测提供了有力手段,有助于我国养殖业对猪A群轮状病毒的防控。
随着猪A群轮状病毒变异株的不断出现，建立快速、灵敏、特异的检测方法尤为重要,以下方面值得进一步深入研究：
- 优化引物设计,提高检测方法的特异性和灵敏度。
- 结合检测技术，如荧光定量PCR、实时荧光定量PCR等,提高检测的准确性和可靠性。
- 研究猪A群轮状病毒的分子生物学特性,为疫苗研发和防控策略提供理论依据。
- 探索猪A群轮状病毒与病原体的混合感染情况,为临床诊断和治疗提供依据。
基于DB21/T 2875-2017标准的猪A群轮状病毒RT-PCR检测方法在猪A群轮状病毒的检测和防控中具有重要意义,为我国养殖业的发展提供了有力保障。
