DB45/T 749-2011标准下猪脑心肌病毒（EMCV）检测技术研究，RT-PCR法的应用与优化

本研究基于DB45/T 749-2011标准，对猪脑心肌（EMCV）检测技术进行了深入研究，通过优化反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法，提高了检测灵敏度和特异性，为猪脑心肌病原检测提供了有效技术支持。

随着我国畜牧业的迅猛发展,猪脑心肌病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）作为一种关键的猪源病原体，给养猪业带来了巨大的经济损失，EMCV主要侵袭猪只，引发猪脑心肌炎、心肌炎等疾病，严重威胁猪只健康和养殖业的稳定，为了有效预防和控制EMCV的传播，及时、准确地进行病毒检测显得尤为关键，本文旨在探讨在DB45/T 749-2011标准指导下，如何运用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对猪脑心肌病毒进行检测，并对其技术要点进行优化。

猪脑心肌病毒（EMCV）是一种单股正链RNA病毒，隶属于卡他科，感染猪只后，可导致猪只出现呼吸困难、生长迟缓、心肌炎等症状，严重时甚至导致死亡，我国已将EMCV列为二类动物疫病，DB45/T 749-2011是我国关于猪脑心肌病毒检测的标准，其中规定了EMCV的检测方法、试剂和仪器等，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法因其高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，在EMCV检测中得到广泛应用。

RT-PCR法检测EMCV的技术要点

样本采集与处理

采集疑似感染猪的脑组织、心肌组织或血液等样本，将样本置于无菌管中，加入适量的裂解液，充分研磨后，离心取上清液作为模板。

引物设计与合成

根据EMCV的基因序列,设计特异性引物，引物设计应遵循以下原则：引物长度在18-25个碱基之间；引物之间避免形成二聚体；引物3'端避免与模板序列互补；引物Tm值相差不超过5℃，引物合成采用生物工程股份有限公司提供的合成服务。

反转录反应

将处理后的样本上清液进行反转录反应,合成cDNA，反应体系包括：cDNA模板、逆转录酶、dNTPs、随机引物、反应缓冲液等，反应条件：50℃、30分钟。

PCR反应

将反转录产物进行PCR扩增,反应体系包括：cDNA模板、上下游引物、dNTPs、Taq酶、反应缓冲液等，反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。

结果分析

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,若出现与预期一致的条带，则判定为阳性样本；若未出现条带，则判定为阴性样本。

RT-PCR法检测EMCV的优化

引物优化

通过对比不同引物的扩增效果,筛选出最佳引物组合，最佳引物应满足以下条件：扩增产物特异性强、灵敏度高等。

反转录反应优化

优化反转录反应条件,提高cDNA的合成效率，如调整反应温度、时间、酶浓度等。

PCR反应优化

优化PCR反应条件,提高扩增效率，如调整退火温度、延伸时间、循环次数等。

试剂与仪器优化

选用高质量的反转录酶、Taq酶等试剂，确保扩增效果，使用性能稳定的PCR仪，保证实验结果的准确性。

本文对DB45/T 749-2011标准下，利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测猪脑心肌病毒的技术要点进行了探讨，并对检测方法进行了优化，通过优化引物、反应条件、试剂与仪器等，提高了EMCV检测的灵敏度和特异性，为我国猪脑心肌病毒的防控提供了有力支持。