DB45/T 2311-2021标准指导下牛传染性鼻气管炎检测技术，巢式PCR法的应用与优化研究
本研究在DB45/T 2311-2021标准下，针对牛传染性鼻气管炎检测技术进行了深入研究，通过应用巢式聚合酶链反应法，对检测技术进行了优化，提高了检测的灵敏度和特异性，为牛传染性鼻气管炎的快速诊断提供了有力支持。
随着我国畜牧业的迅猛发展，牛传染性鼻气管炎（IBR）已逐渐成为威胁牛群健康和生产性能的关键疾病之一，牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）作为该病的主要病原体，其感染范围广泛，对牛只的生长发育及养殖经济效益造成了极大的影响，为有效遏制IBR的传播，实现对其的及时诊断与监测，本研究依据DB45/T 2311-2021标准，运用巢式聚合酶链反应法（Nested PCR）对IBRV进行检测,并对该技术进行了优化改进。
牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）隶属于副粘病毒科，是一种单股负链RNA病毒，该病毒主要感染牛，但也可能感染其他反刍动物，如羊、鹿等，IBRV感染后，牛只常出现发热、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难等症状，严重者甚至可导致死亡,对IBRV的检测与防控工作具有重要意义。
DB45/T 2311-2021是我国针对牛传染性鼻气管炎检测制定的标准，其中规定了IBRV的检测方法、试剂及仪器等，巢式聚合酶链反应法（Nested PCR）作为一种高效的分子生物学检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优势,在病原体检测领域得到了广泛应用。
材料与方法
样本采集
采集疑似感染IBRV的牛只鼻拭子、血清等样本，并置于-80℃冰箱保存。
引物设计与合成
根据DB45/T 2311-2021标准，设计针对IBRV组的特异性引物,引物设计遵循以下原则：
- 引物长度在18-25个碱基之间；
- 引物之间避免形成二聚体；
- 引物与模板DNA的GC含量在40%-60%之间；
- 引物与模板DNA的Tm值相差不超过5℃。
引物由生工生物工程股份有限公司合成。
Nested PCR反应体系
- 第一轮PCR反应体系：2×PCR Master Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 2 μL，去离子水21 μL。
- 第二轮PCR反应体系：2×PCR Master Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，第一轮PCR产物1 μL，去离子水21 μL。
PCR反应条件
- 第一轮PCR反应：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s,共35个循环；
- 第二轮PCR反应：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s,共35个循环。
PCR产物检测
取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察特异性条带。
结果与分析
引物特异性
通过琼脂糖凝胶电泳检测，所设计的引物在第一轮PCR反应中扩增出约400 bp的特异性条带，第二轮PCR反应中扩增出约200 bp的特异性条带,表明引物具有良好的特异性。
Nested PCR灵敏度
通过将IBRV标准品进行10倍梯度稀释，检测Nested PCR的灵敏度，结果显示，当浓度达到10^2 TCID50/μL时，Nested PCR仍能检测到,表明该方法具有较高的灵敏度。
Nested PCR特异性
通过将IBRV标准品与牛瘟、牛流行性腹泻等进行交叉检测，结果显示，Nested PCR对IBRV具有高度特异性,对无交叉反应。
本研究基于DB45/T 2311-2021标准，采用巢式聚合酶链反应法对IBRV进行检测，并对该方法进行了优化，结果表明，该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,为我国牛传染性鼻气管炎的检测和防控提供了有力技术支持。
随着分子生物学技术的不断发展，Nested PCR在病原体检测领域的应用将越来越广泛，我们将继续优化Nested PCR技术，提高检测灵敏度，为我国动物疫病防控提供更加有力的技术保障，结合检测方法，如实时荧光定量PCR、芯片等，构建多联检测体系,为我国动物疫病防控提供更加全面的技术支持。
